一种可靠的磷酸化试剂——二苄基N,N'-二异丙基亚磷酰胺

蛋白质的磷酸化反应在生化过程中扮演了非常重要的角色。其中引入磷酸基团的酶称为激酶，而除去磷酸基团的酶称为磷酸酶。 蛋白质磷酸化可发生在许多种类的氨基酸（蛋白质的主要单位）上，其中以丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸为主。另外，含有磷酸的官能团在一些小分子药物，尤其是核苷酸药物中是非常常见的官能团，例如2013年上市的抗丙肝明星药物索非布韦，以及更为早期的核苷药物替诺福韦、阿德福韦等。此外，随着基因类药物的兴起，一些寡核苷酸类药物也陆续被FDA批准上市，包括：反义寡核苷酸类药物（ASOs）、核酸适配体药物（apatmers）、小分子干扰RNA药物（siRNAs）等。前段时间，70万元一针的“天价”罕见病药物——诺西那生钠被国家医保谈判代表“灵魂砍价”后直接降价到低于3.3万元每针的价格。该消息一经播出立刻刷屏网络，大家都在为国家医保谈判代表喝彩、也为患者家属感到欣慰。然而鲜为人知的是，这个目前全球唯一治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的药物也是一种反义寡核苷酸（ASO）药物（图1）。由此可见，磷酸官能团赋予一些药物非常重要和关键的药理活性。

图1 索非布韦（左）与诺西那生钠（右）

在药物合成中引入磷酸官能团的方法很多，常见的磷酸化试剂包括：三氯氧磷、焦磷酰氯、氯磷酸二甲酯、氯磷酸二苯酯等（图2）。这些磷酸化试剂各有优缺点。三氯氧磷和焦磷酰氯与醇在碱性条件下反应后，经过水解可以得到磷酸基团。这两种试剂的优点是价格低廉、操作简便，但是缺点是产物往往带有少量极性类似杂质，导致产物纯化产生困难。醇也可以先与氯磷酸二甲酯或者二苯酯反应，生成磷酸酯中间体后再脱出保护基得到磷酸官能团。这两种磷酸化试剂生成的磷酸酯中间体都可以分离纯化。磷酸二甲酯中间体一般需要用到三甲基溴硅烷脱出甲酯，对于一些酸敏感的底物这个方法并不合适；而磷酸二苯酯中间体需要化学计量的二氧化铂作为催化剂才能脱出苯基——催化量的二氧化铂或者钯碳是无法脱出苯基的，因而从生产成本的角度看，这种合成方法太过于昂贵。

图2 常见磷酸化试剂

本文介绍一种可靠的磷酸化试剂——二苄基N,N'-二异丙基亚磷酰胺，一种无色或者淡黄色油状物质。二苄基N,N'-二异丙基亚磷酰胺对酸非常敏感。由于该化合物沸点较高（130°C/0.55mmHg），通过减压蒸馏的方法进行纯化相当困难，因而市面上销售的二苄基N,N'-二异丙基亚磷酰胺的纯度通常不大于98%。

图3 二苄基N,N'-二异丙基亚磷酰胺及其应用

用二苄基N,N'-二异丙基亚磷酰胺引入磷酸基团的通常方法分三个步骤：（1）二苄基N,N'-二异丙基亚磷酰胺与醇在四氮唑或4,5-二氰基咪唑等弱酸的催化下生成三价的亚磷酸中间体；（2）亚磷酸中间体氧化成五价的磷酸二苄酯中间体，该中间体可以分离纯化；（3）通过钯碳催化氢化脱出两个苄基得到磷酸官能团。相对于前面提到的磷酸化试剂，二苄基N,N'-二异丙基亚磷酰胺具有反应条件温和、操作简便、中间体易于纯化、生产成本较低等优势。

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